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生物年夜份子的三维布局能够直不雅地揭露其生物学功能、细胞内历程和摸索其在疾病中阐扬感化的体例。冷冻电镜(cryo-electron microscopy,cryo-EM)单颗粒阐发手艺经由过程对生物年夜份子的间接成像进行高分辩率布局测定，已成为布局生物学的主要研究手段。冷冻电镜单颗粒阐发手艺需要对生物年夜份子溶液的冷冻样品收集年夜量电子显微数据，以进行三维布局解析，是以高质量的冷冻样品制备在此中起着相当主要的感化。杰出的制样方式需要可以或许简洁地、可控地制备出接近抱负状况的生物年夜份子冷冻样品。　　诺贝尔化学奖取得者雅克·杜博切特(Jacques Dubochet)等人在1984年发现了冷冻样品制备的滤纸夹置法(Pipet-blot-plunge)，至今依然是冷冻电镜样品制备的首要手段。在这类保守的制样方式中，研究人员难以切确节制样品冰层厚度和年夜份子颗粒散布，致使冷冻样品的均一性和可反复性较差。愈来愈多的证据注解，在样品被冷冻之前的刹时，生物年夜份子会吸附在超薄的液体层的气液界面(Air-water interface, AWI)上，致使生物年夜份子的颗粒布局毁伤、变性或发生劣势取向，减低了高分辩率冷冻电镜布局阐发的效力和成功性。若何获得可反复的高质量的生物年夜份子冷冻样品依然是冷冻电镜手艺利用中的一个困难。图1. ESI-cryoPrep方式设想和仪器装配示企图　　4月25日，清华年夜学生命科学学院王雄伟课题组和周详仪器系欧阳证、周晓煜课题组在《天然·方式学》(Nature Methods)在线颁发了题为“电喷雾辅助的冷冻电镜样品制备方式用以减轻界面吸附效应”(Electrospray-assisted cryo-EM sample preparation to mitigate interfacial effects)的研究论文。研究采取非变性质谱(Native mass spectrometry, native MS)中普遍利用的电喷雾电离(Electrospray ionization, ESI)手艺，设想并搭建了一种新型冷冻样品制备装配ESI-cryoPrep(图1)，成功实现了无需滤纸夹吸的冷冻样品制备，并取得了多种生物年夜份子近原子分辩率的三维布局。　　研究注解，ESI-cryoPrep能够有用地将生物年夜份子颗粒完全嵌入无定形态薄层冰中，避免其吸附在空气-水、固体-水界面上，并对该装配制备生物年夜份子冷冻样品进程中的界面模子进行了机理阐释。ESI-cryoPrep以“软”电离手艺ESI为根本，经由过程向卵白溶液施加高电压构成年夜量带电的卵白液滴，能够有用地削减卵白的变性与碎裂。在电场的驱动下，带电液滴飞向电镜载网的进程中陪伴着去溶剂化的进行；液滴概况的电荷密度激增至瑞利极限致使库仑裂变构成带电的次级液滴；这一进程轮回来去直至液滴终究堆积在电镜载网上；搜集到带电液滴的电镜载网被插入液氮冷却的液态乙烷中便可实现对液滴的快速冷冻。该进程完全省却了滤纸的夹吸，避免了滤纸材料对液体和生物年夜份子的影响。由于液滴概况的小份子离子构成了双电层效应，生物年夜份子与液体的界面被阻遏开，从而避免了生物年夜份子吸附到气液或固液界面上，更好地连结了生物年夜份子的自然布局。该研究初次对ESI液滴中的生物年夜份子的自然布局(Native structures)进行了间接测定，指点取得ESI的“软着陆”电离参数进行冷冻制样与非变性质谱阐发。该工作是冷冻电镜与质谱手艺的交叉融会，配合努力在解答生物年夜份子布局解析与阐发的科学问题。　　研究团队在搭建的装备上，颠末屡次试探肯定了制备高质量冷冻样品的相干参数。这些参数既能知足保留高比例完全布局生物年夜份子颗粒的需求，又能增进带电液滴在附着电镜载网概况的扩大和浸湿。研究团队应用优化的ESI-cryoPrep装配制备了五种生物年夜份子的高质量冷冻样品，取得了与方针生物年夜份子尺寸相对应的抱负冰层厚度，并实现了全数测试样品70Sribosome、20Sproteasome、apo-ferritin、ACE2和streptavidin的高分辩率三维布局解析，分辩率别离为2.7Å、2.0Å、2.1Å、3.3Å和1.9Å。　　研究团队对冷冻电镜数据进行了深切的发掘与阐发，发觉与预期假定分歧的成果。ESI-cryoPrep能够有用地将生物年夜份子颗粒完全嵌入无定形态冰的薄层中心，按捺方针生物年夜份子在空气-水或石墨烯-水界面的吸附(图2)，从而避免卵白质颗粒的布局毁伤或劣势取向问题。研究工作提出了电荷残留模子，说明了电喷雾电离发生的液滴概况的电荷不平均散布庇护卵白质颗粒免在界面吸附的感化和机制。这类学科交叉的研究功效不但将为冷冻电镜样品制备供给利用价值，还将对冷冻电镜手艺和非变性质谱范畴的交叉和成长发生积极影响，为更多立异利用斥地新的可能性。自立研发的高质量冷冻电镜样品制备装配，一方面能够缩短布局解析的漫长摸索进程，更高效地取得高分辩三维布局，阐发其感化机理；另外一方面也晋升了原创研发具有自立常识产权和高精尖手艺的能力，削减对国外相干仪器和装备的依靠。　　图2.ESI-cryoPrep方式制备的冷冻样品中卵白质颗粒在断层成像中的代表性空间散布　　清华年夜学生命科学学院2017级博士生杨梓和周详仪器系2018级博士生范菁津(已卒业)为该论文配合第一作者，清华年夜学生命科学学院传授王雄伟，周详仪器系传授欧阳证和副传授周晓煜为论文配合通信作者。清华年夜学生命科学学院王家副研究员和范潇博士等为课题的启动和推动作出主要进献。研究获得国度天然科学基金、腾讯基金会等的帮助，并获得清华年夜学冷冻电镜中间和计较中间的手艺撑持。